多肽分離對多肽色譜柱的要求比小分子藥物更高。肽鏈兼顧親水與疏水片段，容易在柱頭吸附、在填料間隙聚集，加上流動(dòng)相里常配C?HF?O?一類的離子對試劑，柱子用久了總會出點(diǎn)狀況。其中基線漂移和壓力升高是最常見的兩個(gè)信號，處理思路也很成熟。
基線漂移：先看流動(dòng)相，再看柱子和檢測器
跑多肽反相方法時(shí)，基線本來就該穩(wěn)在毫安級別的噪音帶里。如果開始緩慢爬升、周期性波動(dòng)，或者走梯度時(shí)漂移量明顯大于新柱時(shí)期，可以按下面順序查。
第一步是確認(rèn)流動(dòng)相。多肽方法里乙腈和水通常要加百分之零點(diǎn)一到百分之零點(diǎn)一二的C?HF?O?，這兩瓶液體的配比、批次、pH如果前后不一致，基線一定會漂。超純水放超過三天、乙腈開封太久吸了微量水分，都是常見誘因。建議每次配液都用同一批試劑，超純水當(dāng)天配當(dāng)天用，脫氣至少十五分鐘。
第二步看柱子本身。多肽樣品里如果有未消化的鹽、去垢劑殘留，會慢慢在C18表面累積，表現(xiàn)為梯度洗脫時(shí)基線整體抬高、拖尾變重。這時(shí)候可以先把流速降到0.2毫升每分鐘，用高比例水相沖一小時(shí)，再走5到10個(gè)乙腈梯度循環(huán)做清洗。如果進(jìn)了螯合金屬離子或強(qiáng)保留肽，單靠乙腈洗不掉，可換異丙醇或甲醇-異丙醇1:1沖半小時(shí)，注意壓力別超廠家上限。
第三步排查檢測器。跑空白梯度如果還漂，把檢測器波長切到280納米和214納米對比一下，214納米漂移更明顯多半是流動(dòng)相紫外截止的問題，280納米還漂就要看氘燈能量和流通池有沒有氣泡。
壓力升高：多半是堵了，分清位置再動(dòng)手
多肽柱壓力比新柱時(shí)漲百分之三十以上就該警惕。先跑一針空白，記下各段壓力：如果進(jìn)樣前就高，問題在柱前管路、在線過濾器或柱頭篩板；如果進(jìn)樣后才高且隨樣品變重，多半是填料污染或柱頭塌陷。
柱前堵最常見的是在線過濾器濾芯。拆下來超聲在甲醇-水1:1里，十分鐘還不通就換新的。如果是柱頭篩板堵，可用配套反沖接頭以低流速反向沖十分鐘，能把卡在篩板孔的肽絮聚體推出來。注意反沖只適合可反沖設(shè)計(jì)的柱子，填的是3微米以下小粒徑或核殼的就得謹(jǐn)慎，避免填料松動(dòng)。
填料層污染導(dǎo)致的壓力升高，伴隨峰形前延或分叉。這種情況先用強(qiáng)洗脫溶劑沖，再考慮把柱頭篩板拆下，刮掉最上層一兩毫米填料，補(bǔ)同批填料后換新篩板，能救回一部分性能。當(dāng)然如果柱齡已經(jīng)過千針、分離度掉到初始值九成以下，優(yōu)先考慮換新柱更省事。
日常延緩老化的幾個(gè)習(xí)慣
多肽樣品上機(jī)前建議離心一萬三千g十分鐘或過0.22微米膜，避免微粒進(jìn)柱。高鹽餾分收集完及時(shí)用高水相沖洗過渡，別讓鹽在柱內(nèi)析出。長期不用時(shí)柱子兩頭擰緊保存堵頭，4度存放，重新啟用前先低流速平衡兩小時(shí)再走方法。
基線穩(wěn)不穩(wěn)、壓力漲多少，其實(shí)都是柱子在說話。早發(fā)現(xiàn)早處理，一根肽柱多跑幾百針沒問題。
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